Kvantitatiivinen PCR-pikamääritysmenetelmä viljojen Fusarium-homeille

Authors

• Tapani Yli-Mattila
• Sari Paavanen-Huhtala Turun yliopisto, Biologian laitos, Kasvifysiologia ja molekyylibiologia, 20014 Turku
• Tuija Sarlin VTT Bioteknologia, PL 1500, 02044 VTT
• Marika Jestoi EELA, Kemian laitos, 00581 Helsinki
• Päivi Parikka MTT Kasvintuotanto/Kasvinsuojelu, 31600 Jokioinen
• Aldo Rizzo Yleisvenäläinen Kasvinsuojeluinstituutti, 196608 Pietari, Venäjä
• Auli Haikara VTT Bioteknologia, PL 1500, 02044 VTT
• Tatjana Gagkaeva Yleisvenäläinen Kasvinsuojeluinstituutti, 196608 Pietari, Venäjä
• Sonja Klemsdal Norjan Kasvinsuojeluinstituutti, Hoegskoleveien 7, N1432 Ås, Norja

DOI: https://doi.org/10.33354/smst.76712

Keywords:

DNA, viljat, mykotoksiinit, punahomeet

Abstract

Mykotoksiinien määriin viljoissa EU:ssa on tulossa uusia enimmäismäärärajoja vuonna 2006. Sallittu enimmäismäärä viljojen deoksinivalenoli (DON) pitoisuudelle tulee olemaan ohrassa ja vehnässä 1250 ppb, kaurassa 1750 ppb ja lastenruuissa 200 ppb. Niinpä teollisuus tarvitsee uusia luotettavia pikamääritysmenetelmiä suuren mykotoksiiniriskin omaavien viljaerin löytämiseen tutkittavista viljanäytteistä. Työssä testattiin ensin viittä lajispesifistä lajikeparia SYBR Greeniin perustuvalla kvantitatiivisella PCR:llä vuoden 2002 viljanäytteillä, joiden toksiinimäärät tiedetään. Tulokset olivat kuitenkin vain semikvantitatiivisia eivätkä kovin toistettavia määrien suhteen (hajontaa DNA-määrien suhteen ei-spesifisistä monistustuotteista johtuen), joten emme voineet luotettavasti tutkia eri viljanäytteiden DNA-määrien korrelaatiota toksiinimääriin, vaikka PCR-reaktiota optimoitiin eri tavoilla. Sen sijaan TaqMan-alukkeilla ja koettimilla pystyttiin toistettavasti määrittämään Fusarium graminearum (TMFg12), F. poae (TMpoae), F. sporotrichioides/F.langsethiae (TMLAN), F. avenaceum/F.arthrosporioides (TMAV) ja trikotekeeneita tuottavien Fusarium-lajien (TMTRI) DNA:n määrät suomalaisissa viljanäytteissä GeneAmp 5700 ja LightCycler-laitteilla. Kaikkia TaqMan-alukkeita ja koettimia voidaan käyttää epäilyttävien viljanäytteiden karsimiseen pika-analyysissä esim. viljojen esinäytteiden valinnassa viljelijöiltä ennen yhtiöiden ostopäätöstä. Menetelmä sopii erityisesti kauralla (TMFg12) sekä myös ohralla (TMTRI) ja kevätvehnällä (TMFg12 ja TMTRI) suuria deoksinivalenoli (DON) pitoisuuksia sisältävien näytteiden löytämiseen, ohralla (TMpoae) ja kauralla (TMpoae) suuria nivalenoli (NIV) pitoisuuksia sisältävien viljanäytteiden löytämiseen sekä ohralla (TMAV) suuriamoniliformiini (MON) ja enniatiini (ENN) pitoisuuksia sisältävien näytteiden löytämiseen. Lisäksi menetelmästä on hyötyä (TMLAN) etsittäessä suuria HT2 ja T2pitoisuuksia sisältäviä kauranäytteitä. F. langsethiaen/F. sporotrichioideksen ja F. poaen samanaikainen tunnistaminen sekoitetuista puhdasviljelmistä ja viljanäytteistä onnistui ABI Prism 7700 -laitteella ja antoi erikseen tehtyjen monistusten kanssa yhtäpitävät tulokset. MON- ja ENN-pitoisuudet korreloivat myös vuoden 2002 ohranäytteiden yhdistettyjen F.avenaceum/F.arthrosporioides/F.tricinctum-pitoisuuksien
kanssa. Myös DON-pitoisuudet korreloivat suuntaaantavasti yhdistettyjen F.culmorum/F.graminearum-isolaattipitoisuuksien kanssa. Työ perustuu Pikafus-Tekes-projektin loppuraporttiin ja siitä valmisteilla oleviin julkaisuihin.