Tuotekehityksessä ja tutkimuksessa tarvittavien proteiinien tuottaminen kasveissa perunan A-viruksen avulla
Avainsanat:
perunan A-virus, biotekniikka, vektorivirus, proteiini, vierasproteiinituottoAbstrakti
Viruksien käyttö tuotekehityksen ja tutkimuksen vaatimien proteiinien tuottamiseen, syötävien rokotteiden kehittämiseen ja geeniterapiaan edustavat kasvavia biotekniikan sovellusalueita. Perunan A-virus (PVA) kuuluu potyviruksiin, joiden proteiinit tuotetaan aluksi yhtenä suurena molekyylinä. Se pilkotaan yksittäisiksi proteiineiksi viruksen itsensä tuottamilla entsyymeillä. Siten virusgenomiin lisätty vieras geeni käännetään proteiiniksi virusproteiinien mukana. Lopputuloksena sekä viruksenproteiineja että vierasta proteiinia tuotetaan kasvisoluissa samansuuruinen määrä. PVA:n proteiini-kuoren koontimekanismi sallii perintöaineksen merkittävän lisäyksen ilman, että viruksen tartutuskykymerkittävästi heikkenee. Koska virus monistuu ja leviää koko kasviin, jo melko pieni määrä kasveja riittää huomattavan proteiinimäärän tuottamiseen esimerkiksi säännösten mukaisessa kasvihuoneessa.
Tämän työn tarkoituksena oli hyödyntää PVA:n genomia yhden vieraan proteiinin tai useiden erilaisten proteiinien samanaikaiseen tuottamiseen kasveissa. Aluksi kokeiltiin vieraan geenin kloonaamista viruksen replikaasia ja kuoriproteiinia koodaavien genomialueiden väliin. Työhön valittiin kaksi ihmisestä peräisi olevaa geeniä. Toinen geeneistä tuotti sorsiiniproteiinia, joka toimii sydänlihaksen supistuksen säätelijänä. Toinen puolestaan tuotti S-COMT-entsyymiä (katekoli-O-metyylitransferaasi), jonka aktiivisuuden rajoittaminen auttaa Parkinsonin taudin hoidossa. Kasvissa tuotettua S-COMT:ia voitaisiin käyttää lääkekehityksessä estolääkkeiden testaukseen. Kahden viikon kuluttua tartutuksesta tupakan lehdissä oli entsymaattisesti aktiivista S-COMT:ia n. 1 % lehden liukoisista proteiineista. Sorsiini sen sijaan oli pysymätön kasvisoluissa, sillä sitä ei havaittu mitattavia määriä. Tulos osoitti, että kaikki ihmisen proteiinit eivät sellaisenaan sovellu kasvissa tuotettaviksi.
Transposonimutaatioon perustuneella tutkimuksella oli paikannettu PVA:n P1-proteiinia koodaavalta alueelta kohta, johon voitaisiin siirtää vieras geeni. Asia varmistettiin siirtämällä tähän kohtaan meduusan geeni, joka tuottaa UV-valossa vihreänä fluoresoivaa proteiinia (GFP). GFP-geeniä kantava PVA levisi kasvissa ja lisääntyi n. 30-50 %:iin viruksen normaalista pitoisuudesta. Koko kasvi fluoresoi vihreänä UV-valossa. Sama voitiin havaita myös tuottamalla GFP jo edellä mainitusta, ihmisen proteiinien tuottamiseen käytetystä PVA-genomin kohdasta.
Vieras geeni voidaan sijoittaa myös potyviruksen P1- ja HCpro-proteiineja koodaavien alueiden väliin. Tämä on mahdollista myös PVA:ssa, mikä osoitettiin tässä työssä. Siten samaan PVA-genomiin voitiin siirtää kolme geeniä, yksi kuhunkin kolmesta kloonauskohdasta. Lopputuloksena oli PVA-genomi, jossa GFP-geeni sijaitsi P1:n sisällä, merivuokon lusiferaasigeeni P1/HCpro-kohdassa ja bakteerin beta-glukuronidaasigeeni (GUS) replikaasi/kuoriproteiinikohdassa. Virusgenomin ja itse viruksen pituudet kasvoivat 38 %, mutta virus säilytti tartutuskykynsä. Se levisi kasveissa saavuttaen 10-15 % viruksen normaalista pitoisuudesta. Kaikki kolme vierasta proteiinia tuotettiin huomattavina pitoisuuksina ja aktiivisina kasvien lehdissä.
